专家解读Science+Cell丨近期系列染色质重塑复合物相关重大成果

解读丨陈柱成严丽娟（清华大学）

责编丨迦溆

图片引自：https://www.thoughtco.com/chromatin-373461

核小体是真核生物染色质的基本单位，其核心由～147 bp DNA缠绕组蛋白八聚体形成。染色质重塑复合物利用ATP的能量移动核小体在基因组上的位置和组成成分，在控制染色质结构、调节基因转录等方面具有重大作用。根据结构和功能的特点，染色质重塑复合物可以分四大类：SWI/SNF、CHD、ISWI和INO80【1】。这些分子机器的运行机理，即如何利用ATP水解的能量推动核小体移动和组蛋白交换，一直是一个未解的科学问题。利用冷冻电镜技术，近年来对于这个问题的解答有了突飞猛进【2-5】。

2018年10月12日，来自英国帝国理工学院的Dale B. Wigley课题组和David S. Rueda课题组合作在Science杂志发表长文，解析了酵母SWR1染色质重塑复合物结合核小体的三维结构，并结合单分子FRET实验，揭示了SWR1催化组蛋白变体替换的动力学过程【6】。SWR1属于INO80染色质重塑家族，其主要功能是催化H2A-H2B与H2A.Z-H2B的替换。H2A.Z是H2A的变体，富集在启动子区域，也能抑制异染色质向常染色质的延伸【7】。在染色质的特定位置或特定时期进行组蛋白变体的替换可以改变染色质结构或招募染色质调控因子，是维持不同染色质状态所必需。与其它染色质重塑蛋白不同，SWR1不能移动核小体。因此，SWR1如何利用ATP水解的能量催化H2A-H2B交换尤其让人困惑。

为了研究SWR1，Wigley课题组没有采用常规的提取内源蛋白的方案，而是利用昆虫细胞，体外表达重构了十四个亚基的完整酵母SWR1复合物。通过相同的方法，Wigley课题组今年初解析了INO80复合物的结构【4】。

SWR1复合物全酶的核心催化亚基是Swr1，它的ATPase活性是组蛋白替换的关键。Swr1结合核小体的SHL2位置，这与Ino80 不同，但与其它的染色质重塑蛋白类似。更重要的是，Swr1的结合使DNA在SHL2处产生1 bp凸起（bugle）。为了形成这个凸起，1 bp DNA从进口端被抽进核小体内部。 由于1bp DNA的位移，Swr1的N端结构域和核小体的另一圈DNA之间相互作用加强，限制了核小体的进一步滑动，这是SWR1不具备催化核小体滑动的可能机制。需要特别指出的是，Swr1处于ADP-BeF3 (ATP类似物) 状态。已知的其它染色质重塑蛋白没有发现在ATP结合状态下引起1 bp DNA位移【3-5】。这种异常的局部DNA移动也可能是SWR1没有真正的核小体滑动活性的原因。

复合物全酶中另一个重要的核小体结合元件是Arp6－Swc6异源二聚体。它们通过全酶中的RuvBL亚基（六聚体）与Swr1 作用，稳定了整个复合物的构象。Arp6－Swc6结合进口端DNA，使得该DNA偏离了常规位置～65°，暴露大概2.5圈核小体DNA。突变和生化实验（体外表达重构体系的一大优势）表明Arp6-Swc6 是SWR1组蛋白替换活性的关键。与INO80一样，因为失去了与进口端DNA的作用，H2A－H2B也相应地暴露。这也许是SWR1与INO80共同具有组蛋白替换活性的机理。

作者进一步采用单分子FRET手段监测了SWR1解开核小体末端DNA缠绕的过程。实验表明在加入SWR1复合物和ATP后，末端DNA显著偏离常规位置；而加入ATPγS 和ADP•BeF3也捕捉到DNA解开的现象，这说明SWR1诱导的核小体DNA去缠绕依赖ATP的结合而不是水解。

尽管SWR1在ADP状态下与核小体的作用方式目前仍不清楚，Wigley这个工作的发表使我们理解SWR1催化组蛋白替换的机制又前进了一大步。Dale Wigley是研究DNA解旋酶、滑移酶的大师，早在1999年通过研究PcrA, 提出了 DNA滑移酶的教科书级的inchworm（尺蠖，下图）运动模型【8】。这个模型为理解染色质重塑蛋白的工作机理提供了基础。

inchworm，尺蠖

相对于INO80 和SWR1复合物，人们对SWI/SNF的研究，尤其是哺乳类动物SWI/SNF (mSWI/SNF)，有点滞后。mSWI/SNF是细胞生长、发育和分化等过程所必需的生物大分子，约20%的人类癌症中发现mSWI/SNF的突变【9】。

近日，美国哈佛大学Cigall Kadoch课题组在Cell上发表了题为Modular Organization and Assembly of SWI/SNF Family Chromatin Remodeling Complexes的研究长文，揭示了mSWI/SNF复合物的模块组织和组装通路，并分析了人类疾病相关的突变影响mSWI/SNF的分子机制。

人源SWI/SNF复合物由超过20个基因编码，基于特定的人体组织和发育时期，复合物采用不同的蛋白亚基（paralogs和variants）和组装形式，其结构组成纷繁复杂，难于一一辨认。早在2013年，Kadoch还是博士生的时候，她通过生化和质谱手段，鉴定了不同细胞系的mSWI/SNF组成【10】。在当前的研究中，Kadoch课题组进行了更全面系统的工作，优化了一套稳定的mSWI/SNF复合物纯化策略。他们利用CRISPR-Cas9在HEK293T细胞系中mSWI/SNF相关亚基上导入HA标签，通过一系列蛋白纯化手段，得到了野生型和多种突变体mSWI/SNF复合物。通过分析不同的复合物组成和交联质谱信息，他们鉴定出HEK293T细胞系中三种mSWI/SNF复合物，分别是BAF（BRG1/BRM-associated factor）、PBAF（polybromo-associated BAF）和 ncBAF（non-canonical BAF，一种新发现的复合物）（下图）。

为了更细致地分析各亚基之间的相互作用以及 mSWI/SNF复合物组装的过程，作者敲除不同的亚基，纯化得到不同的复合物，进行交联质谱和网络模块分析。最后，作者提出了mSWI/SNF的组装通路：SMARCC1/SMARCC2和SMARCD1是mSWI/SNF复合物的初始平台（initial core）；initial core、SMARCB1和SMARCE1构成的亚复合物定义为BAF复合物的核心模块(BAF core module)。ARID1和BAF core module形成亚复合物（ARID1/BAF core），然后与DPF2结合，加上ATPase module（含SS18）完成BAF组装；而ARID2与BAF core 形成亚复合物（ARID2/PBAF core），结合BRD7 和PHF10之后招募ATPase module（不含SS18），最后结合 PBRM1完成组装过程。另一方面，GLTSCAR1/1L BRD9和BAF core 结合, 形成ncBAF core module，合并BRD9和ATPase module（含SS18）形成ncBAF复合物。

这个BAF复合物的构成与较早报道略有不同。其中，BRD9在较早研究中是BAF复合物的一个亚基，现在划归到ncBAF中；另外，BCL11似乎在HEK293T细胞系的BAF复合物中没有被发现，而在T－细胞的BAF复合物中存在【10】。这些差异正好体现了mSWI/SNF研究的挑战性。

作者结合含突变位点的BAF复合物的细胞和生化分析，根据勾勒出的mSWI/SNF复合物的组织轮廓，解释了一些高频错义或无义突变影响mSWI/SNF复合物的组装通路和各亚基之间的稳定性进而导致人类癌症及其他相关疾病的可能机理。总之这项研究对于后续mSWI/SNF复合物的结构和功能研究提供了很有参考价值的框架。

Cigall Kadoch，图片来自：http://www.kadochlab.org/gallery/

Cigall Kadoch是一个非常出色的科学家，一直致力于研究哺乳动物SWI/SNF的功能与人类癌症的关联。据说，她在哈佛大学寻找博士后工作时，因为实在太优秀了，没有给她博士后岗位，而是直接让她当独立PI。2015年，Cigall Kadoch当选MIT技术评论“Innovator Under 35”。

注：清华大学生命科学学院陈柱成课题组主要运用结构生物学的方法从事染色质生物学相关研究，近年来连续在Nature上发表两篇研究论文阐述染色质重塑的机理【11,12】。

BioArt补记：就在英国帝国理工学院的Dale B. Wigley课题组和David S. Rueda课题组合作在Science杂志发表长文，解析了酵母SWR1染色质重塑复合物结合核小体的三维结构之后一周左右，来自复旦大学生物医学研究院徐彦辉课题组在Cell Research杂志上发表了题为Cryo-EM structure of human SRCAP complex的研究论文【13】，首次解析了4埃分辨率的人源SRCAP复合物（对应酵母中INO80染色质重塑复合物）冷冻电镜结构，为后续深入研究核小体置换机制奠定了基础。

SRCAP-C为超大复合物，分子量约为1 MDa（1000KDa），包含10个组分（SRCAP, DMAP1, YL1, RUVBL1, RUVBL2, ACTL6A, ARP6, ACTIN, GAS41 and ZNHIT1）。结构和生化研究表明在SRCAP-C中SRCAP不仅具有ATP解旋酶酶活性，还作为支架蛋白帮助复合物组装。其中间部分贯穿RUVBL1-RUVBL2六聚体，其N端和C端分别连接多个SRCAP复合物组成蛋白。 RUVBL1-RUVBL2形成的六聚体为稳定核心，从底部两侧延伸出来SRCAP解旋酶结构域及Actin相关蛋白等模块。这两个相对应的模块具有DNA结合的表面特征，很可能为核小体结合位点。研究工作根据SRCAP同家族蛋白INO80与核小体复合物的结构，模拟了SRCAP与核小体相互作用方式，为后续深入研究核小体置换机制奠定了基础。

参考文献

1    Clapier, C. R. & Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).

2    Liu, X., Li, M., Xia, X., Li, X. & Chen, Z. Mechanism of chromatin remodelling revealed by the Snf2-nucleosome structure. Nature 544, 440-445 (2017).

3    Farnung, L., Vos, S. M., Wigge, C. & Cramer, P. Nucleosome-Chd1 structure and implications for chromatin remodelling. Nature 550, 539-542 (2017).

4    Ayala, R. et al. Structure and regulation of the human INO80-nucleosome complex. Nature 556, 391-395 (2018).

5    Eustermann, S. et al. Structural basis for ATP-dependent chromatin remodelling by the INO80 complex. Nature 556, 386-390 (2018).

6    Willhoft, O. et al. Structure and dynamics of the yeast SWR1-nucleosome complex. Science 362(2018).

7    Talbert, P. B. & Henikoff, S. Histone variants on the move: substrates for chromatin dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 115-126 (2017).

8    Velankar, S. S., Soultanas, P., Dillingham, M. S., Subramanya, H. S. & Wigley, D. B. Crystal structures of complexes of PcrA DNA helicase with a DNA substrate indicate an inchworm mechanism. Cell 97, 75-84 (1999).

9    Hodges, C., Kirkland, J. G. & Crabtree, G. R. The Many Roles of BAF (mSWI/SNF) and PBAF Complexes in Cancer. Cold Spring Harb Perspect. Med. 6(2016).

10  Kadoch, C. et al. Proteomic and bioinformatic analysis of mammalian SWI/SNF complexes identifies extensive roles in human malignancy. Nat. Genet. 45, 592-601 (2013).

11   Yan, L., Wang, L., Tian, Y., Xia, X., & Chen, Z. (2016). Structure and regulation of the chromatin remodeller ISWI. Nature, 540(7633), 466.

12   Liu, X., Li, M., Xia, X., Li, X., & Chen, Z. (2017). Mechanism of chromatin remodelling revealed by the Snf2-nucleosome structure. Nature, 544(7651), 440.

13  Feng, Y., Tian, Y., Wu, Z., & Xu, Y. (2018). Cryo-EM structure of human SRCAP complex. Cell research, 1.

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